暗場顯微鏡的主體與普通明場顯微鏡一樣，*的不同在于照射到被檢物體上的光線發生了變化，普通的顯微鏡都是通過垂直的照射的方式直接照射于被檢物上，然后通過物鏡與目鏡對被檢物進行成像，暗場顯微鏡的誕生對于觀察十分微小的亞粒子有著很大的幫助，尤其適用于觀察溶質粒子的布朗運動原蟲、細菌的鞭毛、偽足運動以及人體體液中螺旋體、尿管形、結晶或各種粒子。

         如圖，暗場顯微鏡的聚光鏡與普通顯微鏡聚光鏡不同，它的作用是使光線成一個錐形照射到被檢物上。同時暗場顯微鏡的照明中，為了達到只讓光線從側面照射被檢物體的目的，需要用一塊遮光板置于備件物體的光軸處，這樣就慮掉了垂直入射光而只有側面的光通過了，如果載物臺無樣品，而聚光鏡的數值孔徑又大于物鏡，那么這個中空的錐形光束就無法進入到物鏡里面，這就是為什么暗場顯微鏡下觀察時背景為黑色的原因。此時若在載物臺上放置被檢物，錐形光束照在被檢物上，在樣品的表面或內部發生反射、衍射和折射，改變了照在物體上光路的方向，使光線進入到物鏡里而成像，下面是在暗場的情況下拍攝的照片：